Nauwkeurigheid van het meten van endotoxine volgens nieuw ontwerp

Nauwkeurigheid van het meten van endotoxine volgens nieuw ontwerp-NEN voorschrift.

Abstract - De juistheid en de precisie van de bepaling van endotoxine in de werkatmosfeer volgens ontwerp-NEN-EN 14031 zijn onderzocht. Drie series gelijke stofmonsters uit composteerbedrijven werden geanalyseerd op endotoxine door drie verschillende laboratoria. Het bleek dat er een aanzienlijk verschil tussen de laboratoria was: maximaal een factor 4,2. De afwijkingen binnen één lab waren beperkt. De conclusie is dat meting van endotoxine door verschillende labs tot aanzienlijke verschillen leidt. Deze conclusie wordt bevestigd door ander vergelijkend onderzoek. Het is nodig om:

In Nederlandse composteerbedrijven wordt de concentratie endotoxine al enige jaren regelmatig gemeten. De concentratie endotoxine bleek zeer sterk van bedrijf tot bedrijf te verschillen. Bovendien varieerde de gemiddelde concentratie endotoxine binnen een bedrijf van jaar tot jaar sterk. Er kon geen duidelijke verklaring in de bedrijfsvoering gevonden worden.

In 2000 is het normblad ontwerp-NEN-EN 14031 getiteld: "Meting van in de lucht aanwezige endotoxine" uitgebracht. Gezien de slechte ervaring met de kwaliteit van metingen van endotoxine is door de branchevereniging "Vereniging van Afval Verwerkers" (VVAV) een onderzoek opgezet en uitgevoerd naar de nauwkeurigheid van de nieuwe NEN-EN meetmethode voor endotoxine in de werkatmosfeer. Het doel was het eenduidig vaststellen van de juistheid en precisie van de bepaling van endotoxine in de werkatmosfeer uitgevoerd volgens het voorschrift van normblad ontwerp-NEN-EN 14031. Zowel de tussen-laboratorium afwijkingen (= systematische fout of 'bias') en de binnen-laboratorium afwijkingen (= toevallige fout of 'random error') zijn onderzocht.

Inhaleerbaar stof werd gemonsterd op 5 vaste plaatsen in twee verschillende composteerinstallaties. Op elk meetpunt is in triplo bemonsterd. Dit is gedaan op 2 dagen waardoor er in totaal drie series van 20 stofmonsters zijn genomen. Ook werden elke dag 3 veldblanco's meegenomen ter controle. De stofmeting is verricht volgens voorschrift MDSH 14/2. De stofmonsters werden in drievoud genomen, door monsterkoppen te gebruiken (IOM-kop) die op onderling gelijke afstand aan een statiefring van 15 cm doorsnee waren bevestigd. Ter controle werd terplekke de windsnelheid gemeten.

Het debiet van gekalibreerde pompen werd vooraf en achteraf gecontroleerd. De stofmetingen op de werkvloer zijn uitgevoerd door een gecertificeerde arbeidshygiënist van een gecertificeerde Arbodienst.

De hoeveelheid stof in elk van de monsters werd door voor- en naweging bepaald bij één lab volgens voorschrift MDSH 14/2. Vervolgens zijn de stoffilters ingevroren en verzonden naar 3 verschillende lab's. Het laboratorium van IRAS van de Universiteit van Utrecht (IRAS), het laboratorium van de Bundesanstalt für Arbeitsschutz und Arbeitsmedizin te Berlijn (BAuA) en het laboratorium van ASCOR ANALYSE in Breda (ASCOR) zijn nationaal en internationaal werkende laboratoria en werden geselecteerd voor de bepaling van endotoxine in de monsters. De drie laboratoria verrichten allen de bepaling van endotoxine volgens het voorschrift van het normblad ontwerp-NEN-EN14031.

Elk laboratorium heeft de bepaling van endotoxine in duplo of triplo verricht. De onderlinge vergelijking is met het gemiddelde van deze duplo- of triplo-bepaling uitgevoerd.

De analyse verliep globaal als volgt: de stoffilters werden na ontdooiing geëxtraheerd. IRAS heeft het extract opnieuw ingevroren, terwijl ASCOR en BAUA dit niet gedaan hebben en de analyse direct uitgevoerd hebben. Op ons verzoek heeft ASCOR eveneens een deel van het extract ingevroren en later bepaald ('na invriezen'). Dit maakt zowel de vergelijking ASCOR - IRAS mogelijk (bepaling na invriezen extract) als de vergelijking BAUA - ASCOR (bepaling zonder invriezen extract). De stoffilters voor het BAUA waren per abuis te lang onderweg, waardoor zij bij aankomst gedeeltelijk ontdooid waren. De monsters konden na aankomst niet direct verwerkt worden; de stoffilters zijn daarom 6 dagen opgeslagen in een koelkast voordat de extractie uitgevoerd is.

Op basis van de veldwaarnemingen bleken één in drievoud genomen monster en één enkelvoudig stofmonster niet juist genomen en deze zijn niet verder meegenomen bij de onderlinge vergelijking.

De windsnelheid lag op alle meetpunten onder de 0,6 m/s. Er is daarom geen reden om aan te nemen dat er een sterke invloed van de wind op de monsterneming van het stof is geweest.

De resultaten van de analyse van endotoxine in de monsters door de drie lab's, uitgedrukt als concentratie in de werkatmosfeer, zijn samengevat in tabel 1. De gegevens zijn per composteerinstallatie gerangschikt. Omdat ASCOR de concentratie heeft bepaald zowel voor het invriezen van het extract als na het invriezen en ontdooien van het extract, zijn beide resultaten gegeven. Het overzicht van tabel 1 laat zien dat er aanzienlijke verschillen tussen de drie lab's werden vastgesteld. De veldblanco's blijken nauwelijks endotoxine te bevatten. Om een duidelijker beeld van de verschillen per laboratorium te krijgen, zijn de resultaten van de lab's tegen elkaar uitgezet: de gegevens van IRAS tegen die van ASCOR in figuur 1. In figuur 1 is de lineaire regressielijn aangegeven. Omdat de blanco's nagenoeg nul zijn, is de regressielijn door de oorsprong getrokken. De hellingshoek van de regressielijn is daarom te beschouwen als het verhoudingsgetal dat de grootte van de onderlinge verschillen weergeeft.

Tabel 1. Endotoxine (EU/m³) in 3 gelijke meetseries, bepaald door drie verschilende lab's

In figuur 1 zijn zowel de ASCOR-resultaten van de directe analyse ('zonder invriezen') als de analyse na invriezen ('na invriezen') opgenomen. Invriezen van extracten is eveneens door IRAS gedaan, dus deze vergelijking is de juiste (= doorgetrokken lijn). De concentratie bepaald door ASCOR blijkt een factor 0,24 lager te zijn dan die bepaald door IRAS. Conclusie: IRAS rapporteert 1/0,24 = 4,2 * hogere concentraties.

Figuur 2 geeft de mate van overeenkomst van de resultaten van IRAS en BAUA. De concentratie die gerapporteerd wordt door IRAS is hoger. Het verschil is een factor 1/0,4 = 2,5. Omdat de extracten niet exact gelijk behandeld zijn, is de interpretatie van deze vergelijking lastig.

Tenslotte is in figuur 3 de overeenkomst tussen ASCOR en BAUA weergegeven. Beide lab's hebben de extracten niet ingevroren, maar direct gemeten. De dikke lijn is gebaseerd op directe analyse van extracten, dus zonder invriezen. De lineaire regressielijn past in dit geval niet goed, de regressielijn met een machts-functie geeft een veel hogere verklaarde variantie (=R²), dus deze is opgenomen. De overeenkomst tussen deze twee lab's is in het lage gebied redelijk, maar in het hogere gebied rapporteert BAUA hogere concentraties.

De verschillen in de endotoxine concentraties tussen de laboratoria kunnen ook veroorzaakt zijn door een systematisch verschil in de hoeveelheid stof op de filters die aan de 3 laboratoria aangeboden zijn. Om na te gaan of dit een rol speelde, is in tabel 2 de concentratie stof gegeven van de series die naar de 3 laboratoria gezonden zijn.

Tabel 2. Concentratie inhaleerbaar stof in de monsters die naar de 3 lab's verzonden zijn.

De gegevens van tabel 2 laten zien dat er slechts minimale verschillen tussen de 3 series zijn. In Figuur 4 zijn de stofconcentraties van de serie monsters die door IRAS zijn geanalyseerd, vergeleken met die van de serie monsters die naar ASCOR zijn gegaan. Omdat de blanco's zo goed als nul zijn, is regressielijn door de oorsprong getrokken. De hellingshoek van de regressielijn is daarom te beschouwen als het getal dat de grootte van de onderlinge verschillen weergeeft. Deze waarde is = 0,87. Dezelfde waarden van de regressielijn van IRAS tegen BAUA = 0,89 en ASCOR tegen BAUA = 0,95. Dit betekent dat er kleine systematische verschillen waren in de 3 series stofmonsters. De verschillen in de hoeveelheid stof in de monsters die naar de 3 laboratoria gegaan zijn, blijven echter onder de {(1/0,87) -1} = 0,15 = 15%. De monsterneming van stof verklaart daarom slechts voor een klein deel de verschillen in de gemeten concentratie endotoxine. Verreweg de grootste foutenbron is de bepaling van endotoxine in het stof.

Hoe groot is de toevallige fout ('random error') van de meting van endotoxine door elk van de drie laboratoria? Om deze vraag te kunnen beantwoorden zijn op 2 plaatsen in beide composteerinstallaties 2 monsters in triplo naast elkaar genomen. Op deze manier hebben we 4 maal een duplo monster naar elk van de drie laboratoria kunnen sturen. Aan de hand van de waarde van deze duplomonsters is de spreiding van resultaten binnen een laboratorium vastgesteld. De binnen-laboratorium fout kan uitgedrukt worden als de relatieve standaarddeviatie = coëfficiënt of variation[1] = CV. Deze CV is voor elk van de drie laboratoria berekend en is voor ASCOR, BAUA en IRAS respectievelijk 17%, 13% en 29%. De CV geeft het totaal van de spreiding weer in de monsterneming van het stof en de analyse van endotoxine in het stof. Aangezien de analyses van de duplo's door IRAS op verschillende dagen zijn gedaan, geeft dit niet alleen de binnen-dag spreiding weer, maar ook de tussen-dag spreiding. Het is daarom begrijpelijk dat de CV van IRAS groter is. Normblad NEN-EN 482 stelt eisen aan meetmethoden voor stoffen in de werkatmosfeer. Het normblad eist een nauwkeurigheid van meetmethoden voor de werkatmosfeer van 30% in het meetbereik van 50 -200% van de MAC-waarde, dus voor endotoxine in het gebied van 100 - 400 EU/m³. De nauwkeurigheid van een meetmethode van 30% is nagenoeg gelijk aan een CV van 15%. De CV van de bepaling van endotoxine ligt voor 1 van de 3 lab's onder deze grens van 15%. Eén lab heeft een toevallige meetfout die een factor 2 groter is dan gewenst. De conclusie is daarom dat de toevallige meetfout van de meting van endotoxine in de werkatmosfeer nog onvoldoende onder controle is, maar niet dramatisch afwijkt van de eisen.

De systematische meetfout ('bias') van de bepaling van endotoxine in de werkatmosfeer is groot. Dit onderzoek laat zien dat de concentratie endotoxine voor een reeks van monsters tot een factor 4,2 (= 420%) kan verschillen tussen lab's die allen het recente normblad ontwerp-NEN-EN 14031 gebruiken en volgen. Een klein deel van de fout wordt veroorzaakt door de monsterneming van stof: deze fout is echter in verhouding heel gering (max. 15% van de totale fout). Verreweg de grootste foutenbron is de bepaling van endotoxine in het stof.

Bij de bepaling van endotoxine in het stof wordt gebruik gemaakt van een reactie in biologisch materiaal. Endotoxine wordt namelijk gekwantificeerd met de gevoelige, maar gemakkelijk beïnvloedbare enzymreactie in de Limulus Amoebocyte Lysaat-test (LAL-test). Dit maakt dat de methode zeer gevoelig is voor diverse stoorinvloeden, als kwaliteit van het water, soort filter, het aantal malen invriezen, de extractievloeistof, etc. De introductie van een genormaliseerde meetmethode (ontwerp-voorschrift NEN-EN 14031) heeft echter nog niet geleid tot een situatie waarbij verschillende laboratoria vergelijkbare uitkomst rapporteren.

Een recent Amerikaans onderzoek naar de verschillen tussen laboratoria bij het meten van endotoxine in katoenstof laat zien dat, zelfs in de tweede fase van de standaardisatie van de meetprocedure, er nog steeds grote verschillen tussen resultaten van verschillende laboratoria kunnen worden gevonden (maximaal verschil is factor 10) (Chun et al, 2001). In een tweede, eveneens zeer recent, Amerikaans onderzoek worden resultaten van een ringstudie van Europese en Amerikaanse laboratoria beschreven. Het onderzoek rapporteert dezelfde resultaten: beperkte binnen-laboratorium fouten, maar verschillen tussen laboratoria van maximaal factor 10 (Reynolds et al, 2002). Een kleiner Duits onderzoek laat echter zien dat na verregaande methodische aanscherping de onderlinge resultaten verbeteren (Linsel, 2002).

Biologische meetmethoden zijn veel gevoeliger voor externe beïnvloeding door stoorfactoren dan de traditionele analytisch-chemische methoden. Het is daarom absoluut nodig om veel meer aandacht te schenken aan de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van deze biologische meetmethode. Verdere detaillering van het meetvoorschrift voor endotoxine in het ontwerp-normblad NEN-EN 14031 is dringend nodig, evenals rigide kwaliteitscontrole. Dit houdt in: (i) er is brede, internationale overeenstemming over het exacte meetvoorschrift en (ii) er is een accreditatie van lab's nodig, waarbij door periodieke ringtesten wordt bepaald, welke lab's voldoen aan de accreditatie-eisen.

De meting van endotoxine, uitgevoerd door verschillende laboratoria volgend ontwerp normblad NEN-EN 14031, levert niet dezelfde meetresultaten. De toetsing van de blootstelling aan de MAC-waarde van endotoxine is voorlopig niet mogelijk.

Dankwoord. Onze dank gaat uit naar arbeidshygienisten van ArboUnie ZuidOost die de metingen en observaties op de verschillende werkplekken hebben uitgevoerd.

[1] Coefficient of Variation = CV. De CV is gelijk aan de relatieve standard deviatie (RSD) = gemiddelde/SD* 100%. Bij duplobepalingen geldt dat CV = Σ %verschil/n * wortel 2.